***Regulace genové exprese

  • důležitá hlavně u mnohobuněčných organismů – z 1 buňky se diferencuje mnoho různých buněčných typů (např. buňky svalové, nervové, krevní,…) – příčinou diferenciace je akumulace různých druhů proteinů, a primárně tedy i RNA
    • všechny zdravé somatické buňky obsahují shodné množství stejných genů a liší se tím, že tyto stejné geny různě využívají
    • důkaz, že v každé buňce všechny geny – pokus: do vajíčka zbaveného jádra injikovat jádro ze somatické buňky → vznikne normální embryo (= základ klonování)
  • housekeeping genes = geny nezbytné pro existenci organismu
    • kódují housekeeping proteins
    • za stabilních podmínek a na optimálním médiu asi 800 genů
  • luxury genes = geny specifické pro diferencované buňky, které produkují proteiny zodpovědné za jejich specifické vlastnosti (např. hemoglobin v retikulocytech [= nezralé erytrocyty])


KONTROLA SYNTÉZY PROTEINŮ

  • regulační body:
    • genová doze – kolik identických genů má organismus pro 1 protein
    • frekvence transkripce – kdy a jak často je gen přepisován – tato úroveň kontroly převažuje (buňka nesyntetizuje nepotřebné intermediáty)
    • sestřih + další úpravy primárního transkriptu (= pre-mRNA = hnRNA, viz ***RNA)
    • stabilita mRNA – pokud nestabilní, častá transkripce
    • frekvence translace – výběr mRNA, která bude překládána
    • regulace aktivity (stability) vzniklých proteinů


REGULACE INICIACE TRANSKRIPCE

  • nejčastější regulace
  • promotor = sekvence nukleotidů, na kterou nasedá RNA-polymeráza
    • určuje směr transkripce
    • iniciační místo (tam transkripce začíná) + sekvence cca 50 nukleotidů před (nutná pro navázání RNA-polymerázy)
    • prokaryota – RNA-polymeráza potřebuje k rozpoznání promotoru sigma-faktor (syn. sigma podjednotka): pro každý typ promotoru jiný typ sigma-faktoru) – po transkripci asi 10 nukleotidů se sigma-faktor odváže a může být znovu využit, přičemž polymeráza pokračuje v transkripci dál
  • regulační sekvence
    • vážou se na ně regulační proteiny – každá regulační sekvence rozpoznávána jedním i více regulačními proteiny
    • řídí zapínání a vypínání genu (zda gen exprimován závisí na typu buňky, okolí, stáří buňky atd.)
    • délka: 10 nukleotidů (jen zapínají na podnět 1 signálu, hl. prokaryota) až 10000 nukleotidů (odpovídají na řadu signálů, hl. eukaryota)
  • rozpoznání určité sekvence DNA regulačním proteinem: díky specifickému povrchu proteinu (DNA-vazebná doména, viz dále), kterým se pevně váže na určitý úsek DNA podle specifických rysů dvoušroubovice (dáno nukleotidovými sekvencemi); většina se váže do velkého žlábku
    • interakce protein-DNA patří mezi nejpevnější a nejspecifičtější molekulové interakce – jednotlivé kontakty slabé, ale dohromady obvykle 20 kontaktů dostatečně specifické a pevné
  • DNA-vazebné domény – stabilní konformační motivy, které se často opakují v interakci protein-DNA – nejtypičtější:
    • homeodomain (homeodoména)
      • tvořena 3 spojenými α-šroubovicemi
    • zinc finger (zinkový prst)
      • α-šroubovice + β-skládaný list – spolu spojeny atomem Zn
      • obvykle kovalentně spojeno několik zinkových prstů
    • leucine zipper (leucinový zip)
      • spojené 2 α-šroubovice, které se jako dimery vážou na DNA a svírají ji mezi sebou
    • winged-helix (forehead) proteins
    • helix-loop-helix proteins – loop = smyčka
    • DNA-vazebné proteiny se často připojují na DNA v párech (dimerech, viz leucinový zip) → zdvojnásobení plochy kontaktu s DNA → zvýšení pevnosti a specifity vazby – párovat mohou i různé druhy proteinů → značné množství sekvencí může být rozpoznáno malým počtem regulačních proteinů

důležité rozdíly iniciace transkripce u prokaryot a eukaryot

PROKARYOTA

EUKARYOTA

mají 1 RNA-polymerázu

mají 3 RNA-polymerázy

-       RNA-pol. I a III  přepisují geny pro tRNA, rRNA, malé strukturní RNA

-       RNA-pol. II  transkribuje geny kódující proteiny (= většina eukaryotických genů)

RNA-polymeráza schopna zahájit transkripci bez pomoci jiných proteinů

RNA-polymerázy vyžadují přítomnost dalších proteinů (= obecné transkripční faktory)

geny kontrolovány 1 regulační sekvencí, která se nachází blízko promotoru

regulační proteiny mohou ovlivňovat iniciaci i ze vzdálenosti několik tisíc nukleotidů od promotoru

+ regulace 1 promotoru mnoha regulačními sekvencemi rozptýlenými v DNA (před/za genem)

 

iniciace transkripce musí probíhat na DNA sbalené do nukleosomů a v mnohem kompaktnějším chromatinu → náročnější



REGULACE U PROKARYOT

  • například bakterie Escherichia coli – genom tvořen cirkulární molekulou DNA – kóduje asi 4000 druhů proteinů, ale v každém okamžiku syntetizována jen malá část z nich (=> reguluje expresi mnoha svých genů dle nutričního zdroje v okolním prostředí (např. lac operon – laktóza, trp operon – tryptofan atd.)

  • operon

    • geny uspořádané stejným způsobem do 1 úseku a přepisované do 1 mRNA (ta je polycistronická = z 1 mRNA se translatuje více proteinů)
    • operony existují jen u prokaryot (u eukaryot geny regulovány individuálně)
    • všechny geny v operonu řízeny 1 promotorem
    • součástí operátor = sekvence, na kterou se váže represor (regulační protein)
      • často palindromy (invertované repetice) – centrálně symetrické → represory jsou dimery
      • pokud se na represor naváže induktor, represor změní konformaci a:
        • je schopen vázat se na operátor → to brání nasednout RNA-polymeráze → transkripce neprobíhá (= trp operon)
        • není schopen vázat se na operátor → RNA-polymeráza může nasednout → transkripce probíhá (= lac operon)
    • např. tryptofanový (trp) operon – pokud tryptofan přítomen v okolí bakterie → transportován do buňky → enzymy pro jeho syntézu nejsou potřeba → operon vypnut

  • regulace tryptofanového operonu

    • vysoká hladina tryptofanu v okolí buňky
      • několik molekul tryptofanu (induktor) se naváže na tryptofanový represor → změna v jeho 3D struktuře → může se navázat na operátor (regulační sekvence 15 nukleotidů) → to fyzicky brání RNA-polymeráze nasednout na promotor → geny tryptofanového operonu se netranskribují (operon je vypnut)
    • nízká hladina tryptofanu v okolí buňky
      • tryptofanový represor neváže molekuly tryptofanu → nenasedne na operátor → RNA-polymeráza může rozpoznat promotor a nasednout → probíhá transkripce všech 5 genů tryptofanového operonu (operon je zapnut)
    • represor spouští/zastavuje syntézu biosyntetických enzymů podle koncentrace konečného produktu dráhy, kterou dané enzymy katalyzují

  • konstitutivní exprese

    • neregulovaná exprese genu
    • gen, který kóduje represor je neustále s nízkou účinností přepisován → stálá nízká hladina v buňce → umožněna rychlá odpověď (např. na zvýšení koncentrace tryptofanu)

  • represory

    • proteiny, které navázáním na DNA zastavují transkripci genů

  • aktivátory

    • proteiny, které navázáním na DNA navozují transkripci genů
    • nutné u promotorů, které jen slabě vážou RNA-polymerázu → po navázání aktivátoru (napomáhá RNA-polymeráze iniciovat transkripci) již plně funkční
    • např. aktivátorový protein CAP – naváže se na něj cAMP (cyklický adenosinmonofosfát) → CAP se naváže na DNA → RNA-polymeráza může začít transkripci
    • cAMP signalizuje vyčerpání glukosy → syntéza enzymů, které umožňují využití jiných sacharidů z okolí


REGULACE U EUKARYOT

  • RNA-polymeráza II není schopna sama začít transkripci – potřebuje obecné transkripční faktory
    • napomáhají RNA-polymeráze nasednout na promotor, oddělit oba řetězce DNA a po iniciaci transkripce ji uvolnit z promotoru, aby mohlo začít prodlužování mRNA
    • rozpoznávají všechny promotory přepisované RNA-polymerázou II (proto „obecné“)
  • cis elementy = místa v DNA × trans elementy = proteiny, které se váží na cis elementy (tedy na DNA)

jak to celé funguje

  • nejdůležitější – rozpoznání krátké sekvence DNA (asi 25 nukleotidů před iniciačním místem transkripce) = TATA box (hl. nukleotidy adenin a thymin) – obecným transkripčním faktorem TFIID
  • TFIID (dvě velmi si podobné proteinové domény) způsobí dramatický lokální ohyb DNA → mohou nasednout ostatní transkripční faktory a RNA-polymeráza → vznikne transkripční iniciační komplex
  • tento komplex brání RNA-polymeráze v prodlužování mRNA → RNA-polymeráza se musí z komplexu uvolnit → transkripční faktor TFIIH (kináza) s pomocí ATP fosforyluje RNA-polymerázu (připojí fosfáty na dlouhý polypeptid, který z ní vyčnívá) → změna její konformace → uvolnění z iniciačního komplexu → zahájena transkripce
    • nakonec se z promotoru uvolní i transkripční faktory a jsou opět využity pro jinou iniciaci transkripce

eukaryotní regulační proteiny

  • obecné transkripční faktory a RNA-polymeráza nestačí – nutné ještě další aktivační proteiny (pomáhají uspořádání obecných transkripčních faktorů a RNA-polymerázy do iniciačního komplexu)
  • enhancery (zesilovače) = místa v DNA, na která se vážou aktivátory → rozvolnění chromozomů × silencery (zeslabovače) = místa v DNA, na která se vážou represory → spiralizace chromozomů
  • aktivační proteiny mohou být navázány až tisíce nukleotidových párů daleko od promotoru a mohou ovlivňovat expresi genu nezávisle na tom, jestli jsou před/za genem
  • DNA mezi enhancerem a promotorem stočena do smyčky → umožněn kontakt aktivátoru a RNA-polymerázy (nebo 1 z obecných transkripčních faktorů) na promotoru
  • aktivátory usnadňují vznik transkripčního iniciačního komplexu × represory jeho vznik zpomalují/blokují
  • eukaryotní regulační proteiny se vážou na sekvence, které jsou ekvivalentní k operátorům (represory) a aktivátor-vazebným sekvencím (aktivátory) u prokaryot

kombinační kontrola

  • regulační proteiny nejsou funkčně samostatné jednotky → tvoří komplexy regulačních proteinů (pozitivní i negativní regulační proteiny)
  • většina DNA mezi regulačními sekvencemi má pouze roli mezerníku (není rozpoznávána žádným regulačním proteinem) – různé ohyby, smyčky → i vzdálená místa mohou být ve skutečnosti velmi blízko
  • regulační proteiny + poloha jimi rozpoznávaných regulačních sekvencí vzhledem k promotoru se liší gen od genu
  • exprese různých genů může být řízena 1 regulačním proteinem
    • pokud chybí protein potřebný striktně → transkripce neproběhne
    • 1 regulační protein může mít rozhodující vliv na zapnutí/vypnutí konkrétního genu doplněním kombinace proteinů → pokud několik genů obsahuje sekvenci rozpoznávanou stejným regulačním proteinem, může ovlivnit všechny tyto geny
    • např. glukokortikoidový receptor (= regulační protein) – pokud se na něj naváže glukokortikoidový hormon → tento receptor se může navázat na regulační oblast na DNA v několika genech
  • jeden regulační protein může spustit tvorbu celého orgánu
    • např. gen eyeless nezbytný pro vývoj oka v hlavové části u drosofily
    • pokus: gen eyeless vložen do segmentu pro vývoj nohy → vzniklo oko na noze
Comments