-
jádro lidské buňky průměr asi 5-8 mikrometrů × DNA v jádře dlouhá
2 metry → DNA velmi
sbalena – tak, že může interagovat
s enzymy + dalšími proteiny
nutnými pro
transkripci, replikaci a reparaci
- chromosom se skládá z 1 dlouhé
lineární
molekuly
DNA, na které jsou navázány proteiny → svinutí
do
kompaktnější struktury
- zdvojený
chromosom
– má
2
chromatidy (každá
chromatida
= 1 vlákno DNA)
- komplex DNA a
proteinů = chromatin (chroma = barva
→ barvitelný)
- proteiny napomáhají
sbalení
+ podílejí
se na
genové expresi,
replikaci a reparaci DNA
- u člověka všechny somatické
buňky obsahují
2 kopie
každého chromosomu 1
páru = homologní chromosomy
× jediný nehomologní pár – pohlavní chromosomy X a Y
STAVBA CHROMOSOMU
- chromatida
–
krátké
(p-)
raménko a dlouhé
(q-)
raménko
- telomery na koncích (repetitivní
sekvence)
- centromera (repetitivní
sekvence)
+ kinetochory = proteinové struktury; při mitóze se na ně připojují
kinetochorová vlákna (~ mikrotubuly); pokud poškozeny
či chybí → chromosom se při mitóze ztrácí a vznikají aneuploidní buňky
TYPY CHROMOSOMŮ
- autozom
- nepohlavní
chromosom
- u člověka v klasické
tělní
buňce 22 párů
- autozomální
dědičnost = dědičnost genů
ležících na
autozomech
- gonozom
- pohlavní
chromosom
- sestava gonozomů se liší dle pohlaví
a typu
určení
pohlaví
(člověk
–
X a Y)
- gonozomální dědičnost = dědičnost genů
ležících v nehomologní
části gonozomů
- homologické
(homologní)
chromosomy
- chromosomy 1 páru
- mají
shodnou
velikost, polohu centromery, stejný
obsah
genů (ne alel!)
- stejným způsobem se barví, párují
se při meióze –
tvoří
bivalenty
- párování
zajišťuje synaptický
komplex
–
proteinová
struktura
(2 laterální
elementy
spojeny příčnými vlákny s centrálním elementem; na
obvodu spiralizované vlákno obou
chromosomů)
- na bivalentech dochází
k procesu crossing-over, jehož
důsledkem je rekombinace
částí
chromatid;
místa překřížení
= chiazmata
- metacentrický (mediocentrický) chromosom
- p- a q-raménko stejně
dlouhé, centromera
uprostřed chromosomu
- může vzniknout při mutaci
translokací 2 akrocentrických chromosomů
(Robertsonovská translokace)
- submetacentrický (submediocentrický) chromosom
- krátké
(p-) a
dlouhé (q-) raménko, centromera
není uprostřed chromosomu
- akrocentrický chromosom
- místo p-raménka satelit (distální
segment
chromozomu oddělený
od
vlastního chromozomu úzkou částí
nazývanou sekundární
konstrikce), centromera téměř na konci
chromosomu
- telocentrický chromosom
- p-raménko chybí, centromera na
konci chromosomu
- acentrický chromosom
- chromosom, který
ztratil
centromeru
-
holocentrický chromosom
- chromosom, u
kterého není
centromera
lokalizována do 1 místa, ale
centromerická aktivita je
rozptýlena po celém chromosomu =
celý chromosom je centromerou
- nelze rozlišit raménka
- při mitóze se připojuje k vláknům dělicího vřeténka po celé
své
délce; pokud se
rozpadne na více menších částí, každý
z fragmentů
si
zachovává
schopnost
aktivně se připojit k dělicímu vřeténku
- pouze u některých organismů: u rostlin čeledi Juncaceae
(sítiny) a
Cyperaceae
(šáchorovité
–
ostřice), u živočichů
hlísti a
pavoukovci
-
polyténní chromosom
- chromosom, na
kterém došlo k několikanásobné
replikaci,
ale nedošlo k následnému rozpadu na
jednotlivé chromatidy (jednochromatidové chromosomy)
- ideální
model
pro studium strukturních aberací (obrovské, snadno
pozorovatelné)
- feminizující
X*
chromosom
- chromosom, který
podmiňuje vznik samičího pohlaví
- XX ♀, X*X ♀, X*Y ♀, XY ♂
–
způsobuje převahu samic
- samice X*Y mají
potomky
X*X : X*Y : XY : YY (neživotaschopní) v poměru 1 : 1 : 1 : 1
- vyskytuje se u
lumíka velkého
stav chromosomů se mění během buněčného
cyklu
- chromosomy
obvykle rozvolněné (dlouhá, tenká, vzájemně
propletená
vlákna)
× kondenzované jen v malé části buněčného cyklu
- vysoce
kondenzované chromosomy v dělících se buňkách (při mitóze) = mitotické
chromosomy
× rozvolněnější
chromosomy = interfázové (interfázní) chromosomy
- kondenzovaný
stav důležitý
při snadném oddělení
zduplikovaných chromosomů
(asistence
mitotického vřeténka)
- vysoce
kondenzované chromosomy také
při meióze
specializované
sekvence DNA zajišťují účinnou replikaci chromosomů
- chromosomy
fungují jako samostatné
strukturní
jednotky
→
každý
se musí
samostatně
zreplikovat,…
→ to kontrolují 3
typy specializovaných sekvencí:
- replikační
počátky
- začátek duplikace
DNA
- většina chromosomů
obsahuje
více počátků
→ zrychlení
replikace
- centromery
- zajišťují
rozchod
replikovaných chromosomů
do dceřiných buněk při mitóze –
na
centromerách proteinové
komplexy
= kinetochory –
ty váží
chromosomy
na dělící
vřeténko a umožňují
tak oddělit se od sebe
- telomery
- na obou koncích chromosomu
- obsahují
repetitivní
sekvence,
které umožňují
replikaci
konců chromosomů
–
DNA-polymeráza může syntetizovat
DNA jen ve směru 5′→3′ → problém při opožďujícím
se řetězci –
primery nemohou
vzniknout na úplném konci
chromosomu → při každé
replikaci
by docházelo ke ztrátám koncových oblastí
- enzym telomeráza
(reverzní
transkriptáza) – přidává mnoho kopií stejné sekvence (má vlastní RNA
komplementární k repetitivní
sekvenci
DNA) →
vznikne templát pro dosyntetizování opožďujícího řetězce
- telomeráza
funguje
jen v embryonálním vývoji (pak
je její
funkce
blokována)
→ po narození
a během života již
nepracuje
→
telomery se při každém buněčném dělení
zkracují, až
dosáhnou určité
délky, kdy se buňka přestává
dělit → 1 z příčin stárnutí
- u člověka telomery dlouhé
na 50-60 dělení
(Hayflickův limit: Hayflick L., Moorhead
P.S. (1961) The
serial
cultivation
of
human diploid cell strains. Experimental Cell Research, 25:585-621) × pro postavení našeho těla stačí mnohem méně + asi 20 % se
využije pro regeneraci
- pojistka proti nádorům
- pokus: myši odebrány geny pro telomerázu
→ nestalo se jí
nic,
pouze měla kratší
telomery
→ až
v 7.
generaci zkráceny natolik, že byl problém v tkáních, které
se
rychle obnovují (střevní
epitel)
- Nobelova cena
za objevení telomerázy (2009) –
Jack W. Szostak
- další funkce
telomer: repetice telomerázových sekvencí
a přilehlé
oblasti
vytvoří strukturu,
která chrání
chromosom
před DNA-nukleázami (ty přednostně
degradují
konce
molekul DNA)
CHROMATIN = komplex DNA
a proteinů
- dle fáze buněčného cyklu se mění
jeho
stav
- v interfázi rozvolněný
→ umožňuje přístup proteinů
potřebných pro expresi
genů/replikaci
- před vstupem do
mitózy další postupné
sbalování
chromatinu
→ vzniknou
vysoce kondenzované mitotické
chromosomy
– zde již
zreplikovaná DNA +
transkripce zastavena
→ kontrola genové
exprese
epigenetika - tzv. chromatinová dědičnost → strukturní i chemické modifikace chromatinu (ne změny v sekvenci nukleotidů!) → acetylace, methylace, ubiquitylace, sumoylace, fosforylace
- velké změny v epigenetické úpravě chromatinu hlavně v embryonálním vývoji, pubertě a při stárnutí; mladí jedinci zpravidla rezistentní; v průběhu ontogeneze epigenetické změny reverzibilní
- např. genomový imprinting (též parentální, gametický)
- imprintovaná alela = methylovaná alela (navázání
–CH3) = neaktivní
alela
→ nemá
fenotypový projev → pokud heterozygot a methylovaná alela je dominantní,
neprojeví se a fenotyp závisí na recesivní alele (tento heterozygot se
pak chová jako recesivní homozygot) - např.
alela A pro červenou barvu a
alela a pro bílou barvu květů
→ normálně
heterozygot Aa červené květy ×
pokud alela A imprintovaná,
heterozygot Aa má bílé květ
- záleží, od kterého rodiče
imprintovaná alela zděděna
- maternální imprinting
(od matky), paternální imprinting
(od otce)
nukleosom
- nukleosomové jádro + sousední spojovací úsek DNA
- základní
jednotka
kondenzace chromatinu
- objevení
struktury:
naštěpení rozvinutého chromatinu
specifickou nukleázou → rozštěpila DNA mezi
jednotlivými nukleosomy (ne úplně na jednotlivé
nukleotidy)
- jádro nukleosomu: komplex 8
histonů = histonový
oktamer
- histony H2A, H2B,
H3, H4 (každý
po 2
molekulách)
+ dvouřetězcová
DNA o délce 146 nukleotidových párů
- DNA obtočena kolem oktameru
1,45x
–
tak se
zkrátí
až
na 1/3
své původní
délky
- histony = malé
proteiny
s vysokým obsahem kladně
nabitých AK (lysin,
arginin) → pevné
navázání histonů na záporně nabité fosfátové skupiny DNA (bez
ohledu na sekvenci)
- v buňce kolem 60
mil. molekul od každého typu! –
evolučně
nejvíce konzervované
proteiny
u eukaryot → nezbytné při formování
chromatinu
- N-konce cílem posttranslačních modifikací
(trčí ven z nukleosomů)
→ acetylace, methylace, ubiquitylace, sumoylace, fosforylace
→ modifikace
vedou ke změnám vazby histonů
na DNA –
rozvolňují/kompaktují strukturu
- nukleosomy od sebe vzdálené
asi 200
nukleotidových párů
(146
omotáno kolem jádra nukleosomu, zbytek asi
50 spojuje sousední jádra)
- nukleosomy nebrzdí
RNA-polymerázu při transkripci,
nejsou překážkou ani při replikaci
–
dochází
jen k reorganizaci nukleosomových proteinů
STRUKTURA CHROMOSOMU (spiralizace)
- několik
úrovní:
- „korálková“ forma
chromatinu (10
nm) –
jen
velmi zřídka
- 30nmetrové
vlákno (30 nm)
- nukleosomy těsně
přiloženy k sobě
→ kompaktnější struktura
- histon H1
–
drží sousední
nukleosomy u sebe v pravidelně
se
opakujícím uspořádání
- rozvolněný
chromosom
nejčastěji v tomto stavu
- smyčky připojené
k centrální
ose
–
odstupují
směrem ven (= průměr chromosomu
700 nm)
- celkový
chromosom
(1400
nm)
- vysoká kondenzace → zablokování
transkripce
(RNA-polymeráza a ostatní
proteiny
se nemohou vázat na DNA)
- stupeň
spiralizace jednotlivých oblastí
DNA závisí
také
na její
aktuální
aktivitě
INTERFÁZOVÉ CHROMOSOMY
- po mitóze se
chromosomy rozvolňují
(dekondenzují)
× ne ve všech
oblastech chromosomu stejně – v rámci 1 chromosomu se mohou vyskytovat
všechny stupně kondenzace (transkribované oblasti rozvolněnější,
nepřepisované kondenzovanější)
- jednotlivé
chromosomy
se liší v různých buněčných typech (v závislosti na
tom, které geny jsou přepisovány)
heterochromatin
- nejvíce kondenzovaná forma
chromatinu (heteros
= odlišný)
- silně
se barvící
oblasti
chromatinu
- > 10 % interfázových chromosomů, hl. v okolí
centromer
a telomer
- transkripčně
inaktivní
- konstitutivní (nikdy se nepřepisuje) a fakultativní (přepisuje se jen
za určitých podmínek)
- pokud se normální
geny
dostanou do heterochromatinové
oblasti,
inaktivují se
- polohový
efekt
–
např. gen white (Drosophila), gen ADE2
(kvasinka)
- typický
příklad:
inaktivace 1 z chromosomů
X u
samic savců
- dvojnásobné
množství
produktů
X
chromosomu by bylo letální
→ 1 chromosom X
(od otce nebo od matky) trvale inaktivován
–
na začátku embryonálního vývoje,
kondenzace náhodná (v dalších buněčných generacích pak
kondenzován vždy stejný
X
chromosom)
- poměr inaktivovaných a aktivovaných X chromosomů
od otce a
od matky je zhruba 1 : 1 (důkaz náhodnosti
procesu) – výjimka jen vačnatci, tam vždy inaktivován X od otce
euchromatin
- zbytek v různém stupni
kondenzace (eu =
pravý, normální)
- v typické
diferencované
eukaryotní
buňce asi 10 %
chromatinu aktivně přepisováno nebo ve
stavu snadno přístupném transkripci
- aktivní
chromatin
- špatně barvitelný
interfázové
chromosomy jsou v jádře organizovány
- každý
chromosom
má své
místo = teritorium
– podílí se i vazba určitých částí chromosomu na
membránu jádra, laminu
- poloha
chromosomu závisí
na:
- velikosti
chromosomu – malé
chromosomy
jsou spíše ve středu, velké
častěji v okrajových částech
- na genové
denzitě
–
genově
chudé
oblasti
blíže k jadernému obalu
- době
replikace
–
oblasti,
které replikovány později, jsou v periferních oblastech a
kolem jadérka
- poloha by se
neměla měnit –
důležité
v expresi → při nádorech dochází
ke změně
uspořádání
- nukleolus (jadérko) = spojení
určitých částí
různých chromosomů, kde jsou geny
pro syntézu rRNA a ribozomálních proteinů
(satelity
akrocentrických chromosomů) + zde
sestavovány ribozomální
podjednotky
(proteiny transportovány z cytoplazmy)
- není
ohraničeno žádnou membránou
- NOR (nucleolus
organizer region) =
oblast formování
jadérka, u člověka jsou to krátká
raménka chromozomů
13, 14,
15, 21 a 22, která
obsahují
geny pro
5,8S, 18S, a
28S rRNA
- mezi teritorii
volné prostory –
v nich enzymy
pro transkripci, replikaci, splicing,…
KARYOTYP
- druhově
charakteristický
soubor
chromosomů v buňce (počet, struktura,
eventuálně
pruhovací
pattern)
- lidské
chromosomy
– skupiny (dělí
se podle
jejich makrostavby):
A – chromosomy
1, 2, 3 – velké metacentrické
B – chromosomy
4, 5 – velké submetacentrické
C – chromosomy
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X – střední submetacentrické
D – chromosomy
13, 14, 15 – střední akrocentrické
E – chromosomy
16, 17, 18 – malé submetacentrické
F – chromosomy
19, 20 – malé metacentrické
G – chromosomy
21, 22, Y – malé akrocentrické
- člověk nemá telocentrické chromosomy
POHLAVNÍ CHROMOSOMY (GONOZOMY)
- chromosomy X a Y (XX ♀, XY ♂)
–
savci (člověk!) a některé
ryby,
obojživelníci, plazi, korýši, hmyz (např.
Drosophila) a některé
rostliny
- chromosomy Z a W (ZZ ♂, ZW ♀)
–
ptáci, motýli a některé
ryby,
obojživelníci, plazi, korýši a některé
rostliny
- pohlaví
homogametické: XX, ZZ ×
heterogametické: XY, ZW
- nepárový
chromosom = Y, W
vznik a
diferenciace gonozomů
- vznik (mutací)
genu určujícího pohlaví na autozomálním páru
- nahromadění
sexuálně
antagonistických genů (výhodných pro 1 pohlaví, pro druhé
nevýhodných) kolem genu
určujícího pohlaví
→ větší
šance dostat se
znovu do stejného pohlaví
- potlačení
rekombinace v okolí
genu určujícího pohlaví
(např. prostřednictvím inverze
–
u vzniku
lidských gonozomů došlo postupně
k 4
inverzím) → aby se nikdy
nedostal do špatného pohlaví
- postupná
divergence
a degenerace nerekombinující
části nepárového gonozomu
gonozomy XY i ZW
vznikly v evoluci mnohokrát
–
ale
mají spoustu
společných znaků
- Y, W menší nebo chybí
- Y, W obsahují
jen málo funkčních genů
- Y, W nesou hodně
nefunkčních pseudogenů (úsek DNA, který má vysokou
homologii s funkčním genem, ale sám není transkribován
–
předpokládá se, že pseudogeny vznikly z
funkčních genů
během evoluce), transpozonů (pohyblivé,
„skákající“ sekvence DNA), repetitivních sekvencí; z velké
části tvořeny
heterochromatinem
- Y, W obsahují
velké
množství
palindromů (sekvencí, které
se čtou stejně
zepředu i zezadu) –
mezi homologními sekvencemi
dochází
často ke genové
konverzi
(= přepisu 1
sekvence podle druhé)
–
může si vybrat,
jestli bude párovat se
sekvencí na stejném nebo druhém vlákně
→ může způsobit zpomalení
hromadění
škodlivých mutací
- nenáhodný
genový
obsah
- XY a ZW prodělávají
podobné
epigenetické
změny během
gametogeneze u heterogametického pohlaví
- chromosomy X a Y
(resp. Z a W) mají
část homologní (= pseudoautosomová
–
geny
jsou v této části v obou kopiích, dědičnost se může jevit jako
autozomální) a heterologní (větší
část, geny obsaženy jen v 1 kopii)
důsledky
evoluce gonozomů
- kompenzace dávky genů
na
chromosomu X (transkripční
up-regulace)
- vzniká
nerovnováha v dávce genů
mezi
pohlavími (♀
nesou 2
kopie X-vázaných genů
×
♂
nesou
jen 1 kopii) → kdyby nebyla vyrovnána, ♀
XX by
vykazovaly dvojnásobnou expresi
X-vázaných genů
než
♂
- savci: u ♀
inaktivace
1 chromosomu X (= lyonizace, viz níže)
- Drosophila: u ♂
zvýšená
transkripce
chromosomu X
- Caenorhabditis
elegans: u ♀
snížená
transkripce
obou chromosomů X
- u ZW organismů
není
kompenzace
dávky genů
(jen lokálně
u některých genů)
–
důvody nejasné
- meiotická
inaktivace
gonozomů
- transkripční
inaktivace
gonozomů během meiózy
- jen u heterogametického pohlaví
- XY inaktivace během
spermatogeneze, ZW inaktivace během oogeneze
- u většiny organismů
–
inaktivované
gonozomy =
heterochromatinové tělísko (sex body)
- význam: speciální
forma běžné
inaktivace
jakékoli nespárované
DNA,
ochrana před sobeckými geny na gonozomech
- problémy:
- Turnerův syndrom (45, X) –
monosomie
–
chybí
1
gonozom
- Klineferterův syndrom (47, XXY) –
trisomie
–
navíc 1 chromosom X
- superfemale (47, XXX) –
více X chromosomů
- supermale (47, XYY) –
navíc 1 Y chromosom
LYONIZACE
- inaktivace
chromosomu X u savců
- způsob kompenzace dávky u
homogametického pohlaví
- pokud v buňce více než
2
chromosomy X (např.
Klineferterův syndrom),
inaktivace všech kromě
jednoho
(buňka má
schopnost
počítat si X
chromosomy)
- 1961 objev
inaktivace – Mary Lyon (odtud lyonizace)
- oba X
chromosomy aktivní jen v časném embryonálním vývoji → inaktivace po vzniku
blastuly (při diferenciaci
buněk)
×
během oogeneze opět X-reaktivace
- inaktivace u většiny placentálních savců
náhodná (nezáleží, jestli X
chromosom pochází
od matky
nebo od otce) × u vačnatců
vždy inaktivován X chromosom
od otce
- inaktivovaný
X
chromosom = Barrovo tělísko
- heterochromatin, kondenzovaný
během interfáze (= sex
chromatin; je barvitelný)
- téměř netranskribován (výjimkou jsou např. geny nacházející
se v části homologní
s chromosomem Y)
- replikace v pozdní
S-fázi buněčného cyklu
- regulace
inaktivace
- XIC (X chromosome inactivation center, sekvence asi
106 nukleotidových párů) – zde
inaktivace začíná a pokračuje podél chromosomu
- pokud delece → chromosom nemůže být inaktivován
- translokace na
autozom → inaktivuje se
autozom
- součástí
XIC je XCE
–
regulační
element → rozhoduje o
tom, zda X chromosom bude inaktivován
- součástí
XIC je lokus
XIST (X-inactive
specific
transcript) – transkribován jen z neaktivního X chromosomu
- produktem je nekódující
RNA → obaluje
chromosom – po sestřihu zůstává v jádře, je součástí
Xist body
× gen TSIX (antisence XIST) – udržuje v aktivním stavu druhý X chromosom
CHROMOSOMOVÉ ABERACE (MUTACE)
A) Změna počtu:
- aneuploidie
–
týká
se 1
chromosomu
- monozomie (např.
Turnerův syndrom
–
45, X0), trisomie (např.
Downův syndrom
–
47, XX,
+21, Klineferterův syndrom
–
47, XXY)
- příčina: nondisjunkce (nerozpojení) homologických chromosomů
při meióze –
oba
chromosomy přejdou do 1 buňky → v jedné
buňce je chromosom
navíc (trisomie), ve druhé
buňce chybí
(monosomie)
- trisomie se objevuje častěji (jedinci přežijí
spíše s chromosomem
navíc, než
kdyby
chyběl)
- trisomie tolerovány spíše u malých chromosomů
a gonozomů
- míra postižení
závisí
na
velikosti chromosomu a jeho genovém obsahu
- lépe snášejí
rostliny
– např. aneuploidie u
durmanu ovlivňuje tvar plodu
- polyploidie, euploidie
–
týká
se celé
sady
chromosomů = genomová
mutace (lépe tolerován sudý
počet násobků)
- polyploidie u
rostlin – využití
v zemědělství
→ větší výnos
tetraploidi:
kukuřice, bavlna, brambor, zelí
hexaploidi:
pšenice, chysantéma
oktaploid: jahodník
- polyploidie u živočichů
–
tolerována u Drosophily, měkkýšů, ještěrek, obojživelníků, ryb (hojná, např. kapr, pstruh,…)
- vyskytuje se i u
člověka a je normální
–
hepatocyty (buňky jater)
B) Změna struktury:
- při reparaci
chromosomových zlomů
(interchromosomové přestavby většího rozsahu), následkem
nerovnoměrného
crossing-overu (intrachromosomové přestavby malého rozsahu)
- mutagen schopný
vyvolat
zlom = klastogen
– např. UV-záření, různé chemické mutageny
- delece
–
vypadnutí
jednoho
nebo více nukleotidů
- např.
Cry
du chat syndrom (delece v 5p) – pláč novorozenců připomíná mňoukání, nízká porodní váha, nízký svalový tonus, IQ asi
20
- duplikace – znásobení
nukleotidů
- inverze
–
převrácení
několika
nukleotidů; nemusí
vadit,
pokud na 1 rameně ×
problém při gametogenezi
- pericentrická inverze
–
zahrnuje
centromeru; mění
typ
chromosomu
- translokace
- nereciproká
translokace
– odtržení
části
chromatidy a připojení na jinou
chromatidu jiného chromosomu
- reciproká
translokace
– vymění se části nehomologních chromosomů
- Robertsonovská
translokace – z akrocentrických chromosomů
vznikne
metacentrický
VIZUALIZACE CHROMOSOMŮ
- klasické
barvení
–
roztok Giemsa-Romanowski (obr. a)
- G-pruhování (GTG) –
trypsin +
Giemsa
- každý
G-pruh
(oblasti genů na chromosomu) má
své
číslo
- R-pruhování (reverse banding) –
acridine-orange (obr. c)
- C-pruhování (constitutive
heterochromatin) – barvení
centromer (obr. d)
- Ag-NOR (nucleolar
organizers) –
barvení
stříbrem –
zviditelnění
satelitů
akrocentrických chromosomů
(oblastí, které
kódují
rRNA)
- fluorescenční
barviva
- DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)
–
modrá
- PI (proprium iodide) –
červená
- chinakrin
–
zelená
–
Q-pruhování (obr. b)
- ethdium bromid
- TOTO
- YOYO
FISH (fluorescent in situ hybridization)
- umožňuje
lokalizovat geny nebo jinou specifickou DNA přímo na
cytogenetickém preparátu
- sonda (angl. probe) –
značená
fluorescenčně
–
váže se ke
komplementárnímu úseku na
denaturovaném chromosomu
- známe sekvenci
DNA, jejíž poloha nás zajímá
na
chromosomu → označíme úsek komplementární
ke genu,
na kterém je navázána fluorescenční
molekula
(sonda) → denaturace
DNA i sondy → renaturace → spojí se vlákno sondy a původní
DNA → svítí
jen část chromosomu
s komplementární
sekvencí
- typy sond:
- satelitní
–
centromerické,
telomerické,
Y-heterochromatinová
- lokus-specifické („genové“)
- malovací
–
celochromosomové, hybridizující s částmi chromosomů
- při vizualizaci často kombinace více typů
sond
(např. lokus-specifická
pro lokus SRY na Y
chromosomu a centromerická)
- SKY (spectral
karyotyping) –
každý
chromosom
specifický odstín, detekce
chromosomových aberací
–
hlavně
translokace)
METODA BUNĚČNÉ HYBRIDIZACE
- používá
se pro přiřazení
lidských genů
k chromosomům
- využití
mezidruhové
hybridizace
mezi myšími a lidskými buňkami
- fúze myší a lidské
buňky vhodných genotypů
→ vzniká
hybridní
buňka obsahující myší i lidské
chromosomy
- selekce produktů
fúze na vhodném médiu (HAT médium –
živiny + hypoxantin + aminopterin + thymidin) –
přežijí
jen
hybridi
- cytogenetická a biochemická, popř. imunologická, analýza hybridních klonů
- charakteristickým rysem je
nestabilita a postupné (náhodné) vytrácení
lidských chromosomů
→ dospěje se ke
stabilní linii jen s několika lidskými chromosomy
- zjišťuje se, který
gen mají
linie
společný
a také
které
chromosomy
→ podle toho se určí, na kterém chromosomu
gen leží
|
