Regulace genové exprese

• • důležitá hlavně u mnohobuněčných organismů – z 1 buňky se diferencuje mnoho různých buněčných typů (např. buňky svalové, nervové, krevní,…) – příčinou diferenciace je akumulace různých druhů proteinů, a primárně tedy i RNA

    • všechny zdravé somatické buňky obsahují shodné množství stejných genů a liší se tím, že tyto stejné geny různě využívají

    • důkaz, že v každé buňce všechny geny – pokus: do vajíčka zbaveného jádra injikovat jádro ze somatické buňky → vznikne normální embryo (= základ klonování)

  • housekeeping genes = geny nezbytné pro existenci organismu

    • kódují housekeeping proteins

    • za stabilních podmínek a na optimálním médiu asi 800 genů

  • luxury genes = geny specifické pro diferencované buňky, které produkují proteiny zodpovědné za jejich specifické vlastnosti (např. hemoglobin v retikulocytech [= nezralé erytrocyty])

KONTROLA SYNTÉZY PROTEINŮ

• • regulační body:

    • genová dóze – kolik identických genů má organismus pro 1 protein

    • frekvence transkripce – kdy a jak často je gen přepisován – tato úroveň kontroly převažuje (buňka nesyntetizuje nepotřebné intermediáty)

    • sestřih + další úpravy primárního transkriptu (= pre-mRNA = hnRNA, viz ***RNA)

    • stabilita mRNA – pokud nestabilní, častá transkripce

    • frekvence translace – výběr mRNA, která bude překládána

    • regulace aktivity (stability) vzniklých proteinů

REGULACE INICIACE TRANSKRIPCE

• • nejčastější regulace

  • promotor = sekvence nukleotidů, na kterou nasedá RNA-polymeráza

    • určuje směr transkripce

    • iniciační místo (tam transkripce začíná) + sekvence cca 50 nukleotidů před (nutná pro navázání RNA-polymerázy)

    • prokaryota – RNA-polymeráza potřebuje k rozpoznání promotoru sigma-faktor (syn. sigma podjednotka): pro každý typ promotoru jiný typ sigma-faktoru) – po transkripci asi 10 nukleotidů se sigma-faktor odváže a může být znovu využit, přičemž polymeráza pokračuje v transkripci dál

• regulační sekvence

  • vážou se na ně regulační proteiny – každá regulační sekvence rozpoznávána jedním i více regulačními proteiny

  • řídí zapínání a vypínání genu (zda gen exprimován závisí na typu buňky, okolí, stáří buňky atd.)

  • délka: 10 nukleotidů (jen zapínají na podnět 1 signálu, hl. prokaryota) až 10000 nukleotidů (odpovídají na řadu signálů, hl. eukaryota)

• • rozpoznání určité sekvence DNA regulačním proteinem: díky specifickému povrchu proteinu (DNA-vazebná doména, viz dále), kterým se pevně váže na určitý úsek DNA podle specifických rysů dvoušroubovice (dáno nukleotidovými sekvencemi); většina se váže do velkého žlábku

    • interakce protein-DNA patří mezi nejpevnější a nejspecifičtější molekulové interakce – jednotlivé kontakty slabé, ale dohromady obvykle 20 kontaktů dostatečně specifické a pevné

  • DNA-vazebné domény – stabilní konformační motivy, které se často opakují v interakci protein-DNA – nejtypičtější:

    • homeodomain (homeodoména)

      • tvořena 3 spojenými α-šroubovicemi

    • zinc finger (zinkový prst)

      • α-šroubovice + β-skládaný list – spolu spojeny atomem Zn

      • obvykle kovalentně spojeno několik zinkových prstů

    • leucine zipper (leucinový zip)

      • spojené 2 α-šroubovice, které se jako dimery vážou na DNA a svírají ji mezi sebou

    • winged-helix (forehead) proteins

    • helix-loop-helix proteins – loop = smyčka

  • DNA-vazebné proteiny se často připojují na DNA v párech (dimerech, viz leucinový zip) → zdvojnásobení plochy kontaktu s DNA → zvýšení pevnosti a specifity vazby – párovat mohou i různé druhy proteinů → značné množství sekvencí může být rozpoznáno malým počtem regulačních proteinů

REGULACE U PROKARYOT

• • například bakterie Escherichia coli – genom tvořen cirkulární molekulou DNA – kóduje asi 4000 druhů proteinů, ale v každém okamžiku syntetizována jen malá část z nich (=> reguluje expresi mnoha svých genů dle nutričního zdroje v okolním prostředí (např. lac operon – laktóza, trp operon – tryptofan atd.)

• operon

  • geny uspořádané stejným způsobem do 1 úseku a přepisované do 1 mRNA (ta je polycistronická = z 1 mRNA se translatuje více proteinů)

    • operony existují jen u prokaryot (u eukaryot geny regulovány individuálně)

    • všechny geny v operonu řízeny 1 promotorem

  • součástí operátor = sekvence, na kterou se váže represor (regulační protein)

    • • často palindromy (invertované repetice) – centrálně symetrické → represory jsou dimery

      • pokud se na represor naváže induktor, represor změní konformaci a:

        • je schopen vázat se na operátor → to brání nasednout RNA-polymeráze → transkripce neprobíhá (= trp operon)

        • není schopen vázat se na operátor → RNA-polymeráza může nasednout → transkripce probíhá (= lac operon)

    • např. tryptofanový (trp) operon – pokud tryptofan přítomen v okolí bakterie → transportován do buňky → enzymy pro jeho syntézu nejsou potřeba → operon vypnut

      • • příklad: regulace tryptofanového operonu

          • vysoká hladina tryptofanu v okolí buňky: několik molekul tryptofanu (induktor) se naváže na tryptofanový represor → změna v jeho 3D struktuře → může se navázat na operátor (regulační sekvence 15 nukleotidů) → to fyzicky brání RNA-polymeráze nasednout na promotor → geny tryptofanového operonu se netranskribují (operon je vypnut)

          • nízká hladina tryptofanu v okolí buňky: tryptofanový represor neváže molekuly tryptofanu → nenasedne na operátor → RNA-polymeráza může rozpoznat promotor a nasednout → probíhá transkripce všech 5 genů tryptofanového operonu (operon je zapnut)

  • represor spouští/zastavuje syntézu biosyntetických enzymů podle koncentrace konečného produktu dráhy, kterou dané enzymy katalyzují

• konstitutivní exprese

  • • neregulovaná exprese genu

    • gen, který kóduje represor je neustále s nízkou účinností přepisován → stálá nízká hladina v buňce → umožněna rychlá odpověď (např. na zvýšení koncentrace tryptofanu)

• represory

  • • proteiny, které navázáním na DNA zastavují transkripci genů

• aktivátory

  • • proteiny, které navázáním na DNA navozují transkripci genů

    • nutné u promotorů, které jen slabě vážou RNA-polymerázu → po navázání aktivátoru (napomáhá RNA-polymeráze iniciovat transkripci) již plně funkční

    • např. aktivátorový protein CAP – naváže se na něj cAMP (cyklický adenosinmonofosfát) → CAP se naváže na DNA → RNA-polymeráza může začít transkripci

    • cAMP signalizuje vyčerpání glukosy → syntéza enzymů, které umožňují využití jiných sacharidů z okolí

REGULACE U EUKARYOT

• • RNA-polymeráza II není schopna sama začít transkripci – potřebuje obecné transkripční faktory

    • napomáhají RNA-polymeráze nasednout na promotor, oddělit oba řetězce DNA a po iniciaci transkripce ji uvolnit z promotoru, aby mohlo začít prodlužování mRNA

    • rozpoznávají všechny promotory přepisované RNA-polymerázou II (proto „obecné“)

  • cis elementy = místa v DNA × trans elementy = proteiny, které se váží na cis elementy (tedy na DNA)

Jak to celé funguje

• • nejdůležitější – rozpoznání krátké sekvence DNA (asi 25 nukleotidů před iniciačním místem transkripce) = TATA box (hl. nukleotidy adenin a thymin) – obecným transkripčním faktorem TFIID

  • TFIID (dvě velmi si podobné proteinové domény) způsobí dramatický lokální ohyb DNA → mohou nasednout ostatní transkripční faktory a RNA-polymeráza → vznikne transkripční iniciační komplex

  • tento komplex brání RNA-polymeráze v prodlužování mRNA → RNA-polymeráza se musí z komplexu uvolnit → transkripční faktor TFIIH (kináza) s pomocí ATP fosforyluje RNA-polymerázu (připojí fosfáty na dlouhý polypeptid, který z ní vyčnívá) → změna její konformace → uvolnění z iniciačního komplexu → zahájena transkripce

  • nakonec se z promotoru uvolní i transkripční faktory a jsou opět využity pro jinou iniciaci transkripce

Eukaryotní regulační proteiny

• • obecné transkripční faktory a RNA-polymeráza nestačí – nutné ještě další aktivační proteiny (pomáhají uspořádání obecných transkripčních faktorů a RNA-polymerázy do iniciačního komplexu)

  • enhancery (zesilovače) = místa v DNA, na která se vážou aktivátory → rozvolnění chromozomů × silencery (zeslabovače) = místa v DNA, na která se vážou represory → spiralizace chromozomů

  • aktivační proteiny mohou být navázány až tisíce nukleotidových párů daleko od promotoru a mohou ovlivňovat expresi genu nezávisle na tom, jestli jsou před/za genem

  • DNA mezi enhancerem a promotorem stočena do smyčky → umožněn kontakt aktivátoru a RNA-polymerázy (nebo 1 z obecných transkripčních faktorů) na promotoru

  • aktivátory usnadňují vznik transkripčního iniciačního komplexu × represory jeho vznik zpomalují/blokují

  • eukaryotní regulační proteiny se vážou na sekvence, které jsou ekvivalentní k operátorům (represory) a aktivátor-vazebným sekvencím (aktivátory) u prokaryot

Kombinační kontrola

• • regulační proteiny nejsou funkčně samostatné jednotky → tvoří komplexy regulačních proteinů (pozitivní i negativní regulační proteiny)

  • většina DNA mezi regulačními sekvencemi má pouze roli mezerníku (není rozpoznávána žádným regulačním proteinem) – různé ohyby, smyčky → i vzdálená místa mohou být ve skutečnosti velmi blízko

  • regulační proteiny + poloha jimi rozpoznávaných regulačních sekvencí vzhledem k promotoru se liší gen od genu

  • exprese různých genů může být řízena 1 regulačním proteinem

    • pokud chybí protein potřebný striktně → transkripce neproběhne

    • 1 regulační protein může mít rozhodující vliv na zapnutí/vypnutí konkrétního genu doplněním kombinace proteinů → pokud několik genů obsahuje sekvenci rozpoznávanou stejným regulačním proteinem, může ovlivnit všechny tyto geny

    • např. glukokortikoidový receptor (= regulační protein) – pokud se na něj naváže glukokortikoidový hormon → tento receptor se může navázat na regulační oblast na DNA v několika genech

  • jeden regulační protein může spustit tvorbu celého orgánu

    • např. gen eyeless nezbytný pro vývoj oka v hlavové části u drosofily

    • pokus: gen eyeless vložen do segmentu pro vývoj nohy → vzniklo oko na noze