Chromosomy

stav chromosomů se mění během buněčného cyklu

• • chromosomy obvykle rozvolněné (dlouhá, tenká, vzájemně propletená vlákna)

  • × kondenzované jen v malé části buněčného cyklu

  • vysoce kondenzované chromosomy v dělících se buňkách (při mitóze) = mitotické chromosomy

  • × rozvolněnější chromosomy = interfázové (interfázní) chromosomy

  • kondenzovaný stav důležitý při snadném oddělení zduplikovaných chromosomů (asistence mitotického vřeténka)

  • vysoce kondenzované chromosomy také při meióze

specializované sekvence DNA zajišťují  účinnou replikaci chromosomů

• • chromosomy fungují jako samostatné strukturní jednotky → každý se musí samostatně zreplikovat,…

  • → to kontrolují 3 typy specializovaných sekvencí:

    • replikační počátky

    • začátek duplikace DNA

      • většina chromosomů obsahuje více počátků → zrychlení replikace

  • centromery

    • • zajišťují rozchod replikovaných chromosomů do dceřiných buněk při mitóze – na centromerách proteinové komplexy = kinetochory – ty váží chromosomy na dělící vřeténko a umožňují tak oddělit se od sebe

  • telomery

    • na obou koncích chromosomu

      • obsahují repetitivní sekvence, které umožňují replikaci konců chromosomů – DNA-polymeráza může syntetizovat DNA jen ve směru 5′→3′ → problém při opožďujícím se řetězci – primery nemohou vzniknout na úplném konci chromosomu → při každé replikaci by docházelo ke ztrátám koncových oblastí

      • enzym telomeráza (reverzní transkriptáza) – přidává mnoho kopií stejné sekvence (má vlastní RNA komplementární k repetitivní sekvenci DNA) → vznikne templát pro dosyntetizování opožďujícího řetězce

      • telomeráza funguje jen v embryonálním vývoji (pak je její funkce blokována) → po narození a během života již nepracuje → telomery se při každém buněčném dělení zkracují, až dosáhnou určitédélky, kdy se buňka přestává dělit → 1 z příčin stárnutí

        • u člověka telomery dlouhé na 50-60 dělení (Hayflickův limit: Hayflick L., Moorhead P.S. (1961) The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research, 25:585-621) × pro postavení našeho těla stačí mnohem méně + asi 20 % se využije pro regeneraci

      • pojistka proti nádorům

        • pokus: myši odebrány geny pro telomerázu → nestalo se jí nic, pouze měla kratší telomery → až v 7. generaci zkráceny natolik, že byl problém v tkáních, které se rychle obnovují (střevní epitel)

        • Nobelova cena za objevení telomerázy (2009) – Jack W. Szostak

      • další funkce telomer: repetice telomerázových sekvencí a přilehlé oblasti vytvoří strukturu, která chrání chromosom před DNA-nukleázami (ty přednostně degradují konce molekul DNA)

CHROMATIN = komplex DNA a proteinů

• • dle fáze buněčného cyklu se mění jeho stav

    • v interfázi rozvolněný → umožňuje přístup proteinů potřebných pro expresi genů/replikaci

    • před vstupem do mitózy další postupné sbalování chromatinu → vzniknou vysoce kondenzované mitotické chromosomy – zde již zreplikovaná DNA + transkripce zastavena

    • → kontrola genové exprese

epigenetika 

• • • tzv. chromatinová dědičnost → strukturní i chemické modifikace chromatinu (ne změny v sekvenci nukleotidů!) → acetylace, methylace, ubiquitylace, sumoylace, fosforylace

    • velké změny v epigenetické úpravě chromatinu hlavně v embryonálním vývoji, pubertě a při stárnutí; mladí jedinci zpravidla rezistentní; v průběhu ontogeneze epigenetické změny reverzibilní

    • např. genomový imprinting (též parentální, gametický)

      • imprintovaná alela = methylovaná alela (navázání –CH3) = neaktivní alela

      • → nemá fenotypový projev → pokud heterozygot a methylovaná alela je dominantní, neprojeví se a fenotyp závisí na recesivní alele (tento heterozygot se pak chová jako recesivní homozygot)

      • např. alela A pro červenou barvu a alela a pro bílou barvu květů

      • → normálně heterozygot Aa červené květy × pokud alela A imprintovaná, heterozygot Aa má bílé květ

      • záleží, od kterého rodiče imprintovaná alela zděděna

      • maternální imprinting (od matky), paternální imprinting (od otce)

nukleosom

• nukleosomové jádro + sousední spojovací úsek DNA

  • základní jednotka kondenzace chromatinu

  • objevení struktury: naštěpení rozvinutého chromatinu specifickou nukleázou → rozštěpila DNA mezi jednotlivými nukleosomy (ne úplně na jednotlivé nukleotidy)

  • jádro nukleosomu: komplex 8 histonů = histonový oktamer

    • histony H2A, H2B, H3, H4 (každý po 2 molekulách)

    • + dvouřetězcová DNA o délce 146 nukleotidových párů

  • DNA obtočena kolem oktameru 1,45x – tak se zkrátí až na 1/3 své původní délky

  • histony = malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých AK (lysin, arginin) → pevné navázání histonů na záporně nabité fosfátové skupiny DNA (bez ohledu na sekvenci)

    • v buňce kolem 60 mil. molekul od každého typu! – evolučně nejvíce konzervované proteiny u eukaryot → nezbytné při formování chromatinu

    • N-konce cílem posttranslačních modifikací (trčí ven z nukleosomů) → acetylace, methylace, ubiquitylace, sumoylace, fosforylace → modifikace vedou ke změnám vazby histonů na DNA –rozvolňují/kompaktují strukturu

  • nukleosomy od sebe vzdálené asi 200 nukleotidových párů (146 omotáno kolem jádra nukleosomu, zbytek asi 50 spojuje sousední jádra)

  • nukleosomy nebrzdí RNA-polymerázu při transkripci, nejsou překážkou ani při replikaci – dochází jen k reorganizaci nukleosomových proteinů

STRUKTURA CHROMOSOMU (spiralizace)

• několik úrovní:

  • • „korálková“ forma chromatinu (10 nm) – jen velmi zřídka

• • 30nmetrové vlákno (30 nm)

    • • nukleosomy těsně přiloženy k sobě → kompaktnější struktura

      • histon H1 – drží sousední nukleosomy u sebe v pravidelně se opakujícím uspořádání

      • rozvolněný chromosom nejčastěji v tomto stavu

• • • smyčky připojené k centrální ose – odstupují směrem ven (= průměr chromosomu 700 nm)

    • celkový chromosom (1400 nm)

• • vysoká kondenzace → zablokování transkripce (RNA-polymeráza a ostatní proteiny se nemohou vázat na DNA)

  • stupeň spiralizace jednotlivých oblastí DNA závisí také na její aktuální aktivitě

INTERFÁZOVÉ CHROMOSOMY

• • po mitóze se chromosomy rozvolňují (dekondenzují)

  • × ne ve všech oblastech chromosomu stejně – v rámci 1 chromosomu se mohou vyskytovat všechny stupně kondenzace (transkribované oblasti rozvolněnější, nepřepisované kondenzovanější)

  • jednotlivé chromosomy se liší v různých buněčných typech (v závislosti na tom, které geny jsou přepisovány)

heterochromatin

• nejvíce kondenzovaná forma chromatinu (heteros = odlišný)

  • silně se barvící oblasti chromatinu

  • > 10 % interfázových chromosomů, hl. v okolí centromer a telomer

  • transkripčně inaktivní

• konstitutivní (nikdy se nepřepisuje) a fakultativní (přepisuje se jen za určitých podmínek)

  • pokud se normální geny dostanou do heterochromatinové oblasti, inaktivují se

    • polohový efekt – např. gen white (Drosophila), gen ADE2 (kvasinka)

  • typický příklad: inaktivace 1 z chromosomů X u samic savců

    • dvojnásobné množství produktů X chromosomu by bylo letální → 1 chromosom X (od otce nebo od matky) trvale inaktivován – na začátku embryonálního vývoje, kondenzace náhodná (v dalších buněčných generacích pak kondenzován vždy stejný X chromosom)

    • poměr inaktivovaných a aktivovaných X chromosomů od otce a od matky je zhruba 1 : 1 (důkaz náhodnosti procesu) – výjimka jen vačnatci, tam vždy inaktivován X od otce

euchromatin

• zbytek v různém stupni kondenzace (eu = pravý, normální)

  • v typické diferencované eukaryotní buňce asi 10 % chromatinu aktivně přepisováno nebo ve stavu snadno přístupném transkripci

  • aktivní chromatin

• špatně barvitelný

interfázové chromosomy jsou v jádře organizovány

• • každý chromosom má své místo = teritorium – podílí se i vazba určitých částí chromosomu na membránu jádra, laminu

  • poloha chromosomu závisí na:

    • velikosti chromosomu – malé chromosomy jsou spíše ve středu, velké častěji v okrajových částech

    • na genové denzitě – genově chudé oblasti blíže k jadernému obalu

    • době replikace – oblasti, které replikovány později, jsou v periferních oblastech a kolem jadérka

  • poloha by se neměla měnit – důležité v expresi → při nádorech dochází ke změně uspořádání

  • nukleolus (jadérko) = spojení určitých částí různých chromosomů, kde jsou geny pro syntézu rRNA a ribozomálních proteinů (satelity akrocentrických chromosomů) + zde sestavovány ribozomální podjednotky (proteiny transportovány z cytoplazmy)

    • není ohraničeno žádnou membránou

    • NOR (nucleolus organizer region) = oblast formování jadérka, u člověka jsou to krátká raménka chromozomů 13, 14, 15, 21 a 22, která obsahují geny pro 5,8S, 18S, a 28S rRNA

  • mezi teritorii volné prostory – v nich enzymy pro transkripci, replikaci, splicing,…

KARYOTYP

• • druhově charakteristický soubor chromosomů v buňce (počet, struktura, eventuálně pruhovací pattern)

  • lidské chromosomy – skupiny (dělí se podle jejich makrostavby):

    • A – chromosomy 1, 2, 3 – velké metacentrické

    • B – chromosomy 4, 5 – velké submetacentrické

    • C – chromosomy 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X – střední submetacentrické

    • D – chromosomy 13, 14, 15 – střední akrocentrické

    • E – chromosomy 16, 17, 18 – malé submetacentrické

    • F – chromosomy 19, 20 – malé metacentrické

    • G – chromosomy 21, 22, Y – malé akrocentrické

  • člověk nemá telocentrické chromosomy

POHLAVNÍ CHROMOSOMY (GONOZOMY)

• • chromosomy X a Y (XX ♀, XY ♂) – savci (člověk!) a některé ryby, obojživelníci, plazi, korýši, hmyz (např. Drosophila) a některé rostliny

  • chromosomy Z a W (ZZ ♂, ZW ♀) – ptáci, motýli a některé ryby, obojživelníci, plazi, korýši a některé rostliny

  • pohlaví homogametické: XX, ZZ × heterogametické: XY, ZW

  • nepárový chromosom = Y, W

  • vznik a diferenciace gonozomů

    1. vznik (mutací) genu určujícího pohlaví na autozomálním páru

    2. nahromadění sexuálně antagonistických genů (výhodných pro 1 pohlaví, pro druhé nevýhodných) kolem genu určujícího pohlaví → větší šance dostat se znovu do stejného pohlaví

    3. potlačení rekombinace v okolí genu určujícího pohlaví (např. prostřednictvím inverze – u vzniku lidských gonozomů došlo postupně k 4 inverzím) → aby se nikdy nedostal do špatného pohlaví

    4. postupná divergence a degenerace nerekombinující části nepárového gonozomu

  • gonozomy XY i ZW vznikly v evoluci mnohokrát – ale mají spoustu společných znaků

  • Y, W menší nebo chybí

• • • Y, W obsahují jen málo funkčních genů

    • Y, W nesou hodně nefunkčních pseudogenů (úsek DNA, který má vysokou homologii s funkčním genem, ale sám není transkribován – předpokládá se, že pseudogeny vznikly z funkčních genů během evoluce), transpozonů (pohyblivé, „skákající“ sekvence DNA), repetitivních sekvencí; z velké části tvořeny heterochromatinem

    • Y, W obsahují velké množství palindromů (sekvencí, které se čtou stejně zepředu i zezadu) – mezi homologními sekvencemi dochází často ke genové konverzi (= přepisu 1 sekvence podle druhé) – může si vybrat, jestli bude párovat se sekvencí na stejném nebo druhém vlákně → může způsobit zpomalení hromadění škodlivých mutací

    • nenáhodný genový obsah

    • XY a ZW prodělávají podobné epigenetické změny během gametogeneze u heterogametického pohlaví

    • chromosomy X a Y (resp. Z a W) mají část homologní (= pseudoautosomová – geny jsou v této části v obou kopiích, dědičnost se může jevit jako autozomální) a heterologní (větší část, geny obsaženy jen v 1 kopii)

• • důsledky evoluce gonozomů

• • • kompenzace dávky genů na chromosomu X (transkripční up-regulace)

      • vzniká nerovnováha v dávce genů mezi pohlavími (♀ nesou 2 kopie X-vázaných genů × ♂ nesou jen 1 kopii) → kdyby nebyla vyrovnána, ♀ XX by vykazovaly dvojnásobnou expresi X-vázaných genůnež ♂

      • savci: u ♀ inaktivace 1 chromosomu X (= lyonizace, viz níže)

      • Drosophila: u ♂ zvýšená transkripce chromosomu X

      • Caenorhabditis elegans: u ♀ snížená transkripce obou chromosomů X

      • u ZW organismů není kompenzace dávky genů (jen lokálně u některých genů) – důvody nejasné

    • meiotická inaktivace gonozomů

      • transkripční inaktivace gonozomů během meiózy

    • jen u heterogametického pohlaví

    • XY inaktivace během spermatogeneze, ZW inaktivace během oogeneze

      • u většiny organismů – inaktivované gonozomy = heterochromatinové tělísko (sex body)

      • význam: speciální forma běžné inaktivace jakékoli nespárované DNA, ochrana před sobeckými geny na gonozomech

• problémy:

  • • Turnerův syndrom (45, X) – monosomie – chybí 1 gonozom

    • Klineferterův syndrom (47, XXY) – trisomie – navíc 1 chromosom X

    • superfemale (47, XXX) – více X chromosomů

    • supermale (47, XYY) – navíc 1 Y chromosom

LYONIZACE

• inaktivace chromosomu X u savců

• způsob kompenzace dávky u homogametického pohlaví

  • pokud v buňce více než 2 chromosomy X (např. Klineferterův syndrom), inaktivace všech kromě jednoho (buňka má schopnost počítat si X chromosomy)

  • 1961 objev inaktivace – Mary Lyon (odtud lyonizace)

  • oba X chromosomy aktivní jen v časném embryonálním vývoji → inaktivace po vzniku blastuly (při diferenciaci buněk) × během oogeneze opět X-reaktivace

  • inaktivace u většiny placentálních savců náhodná (nezáleží, jestli X chromosom pochází od matky nebo od otce) × u vačnatců vždy inaktivován X chromosom od otce

• inaktivovaný X chromosom = Barrovo tělísko

  • • heterochromatin, kondenzovaný během interfáze (= sex chromatin; je barvitelný)

    • téměř netranskribován (výjimkou jsou např. geny nacházející se v části homologní s chromosomem Y)

    • replikace v pozdní S-fázi buněčného cyklu

• regulace inaktivace

  • • XIC (X chromosome inactivation center, sekvence asi 106 nukleotidových párů) – zde inaktivace začíná a pokračuje podél chromosomu

    • pokud delece → chromosom nemůže být inaktivován

    • translokace na autozom → inaktivuje se autozom

    • součástí XIC je XCE – regulační element → rozhoduje o tom, zda X chromosom bude inaktivován

    • součástí XIC je lokus XIST (X-inactive specific transcript) – transkribován jen z neaktivního X chromosomu

      • produktem je nekódující RNA → obaluje chromosom – po sestřihu zůstává v jádře, je součástí Xist body

      • × gen TSIX (antisence XIST) – udržuje v aktivním stavu druhý X chromosom

CHROMOSOMOVÉ ABERACE (MUTACE)

A) Změna počtu:

• • aneuploidie – týká se 1 chromosomu

    • monozomie (např. Turnerův syndrom – 45, X0), trisomie (např. Downův syndrom – 47, XX, +21, Klineferterův syndrom – 47, XXY)

    • příčina: nondisjunkce (nerozpojení) homologických chromosomů při meióze – oba chromosomy přejdou do 1 buňky → v jedné buňce je chromosom navíc (trisomie), ve druhé buňce chybí (monosomie)

    • trisomie se objevuje častěji (jedinci přežijí spíše s chromosomem navíc, než kdyby chyběl)

    • trisomie tolerovány spíše u malých chromosomů a gonozomů

    • míra postižení závisí na velikosti chromosomu a jeho genovém obsahu

    • lépe snášejí rostliny – např. aneuploidie u durmanu ovlivňuje tvar plodu

  • polyploidie, euploidie – týká se celé sady chromosomů = genomová mutace (lépe tolerován sudý počet násobků)

    • polyploidie u rostlin – využití v zemědělství → větší výnos

      • tetraploidi: kukuřice, bavlna, brambor, zelí

      • hexaploidi: pšenice, chysantéma

      • oktaploid: jahodník

    • polyploidie u živočichů – tolerována u Drosophily, měkkýšů, ještěrek, obojživelníků, ryb (hojná, např. kapr, pstruh,…)

      • vyskytuje se i u člověka a je normální – hepatocyty (buňky jater) 

B) Změna struktury:

• • při reparaci chromosomových zlomů (interchromosomové přestavby většího rozsahu), následkem nerovnoměrného crossing-overu (intrachromosomové přestavby malého rozsahu)

  • mutagen schopný vyvolat zlom = klastogen – např. UV-záření, různé chemické mutageny

  • delece – vypadnutí jednoho nebo více nukleotidů

    • např. Cry du chat syndrom (delece v 5p) – pláč novorozenců připomíná mňoukání, nízká porodní váha, nízký svalový tonus, IQ asi 20

  • duplikace – znásobení nukleotidů

  • inverze – převrácení několika nukleotidů; nemusí vadit, pokud na 1 rameně × problém při gametogenezi

    • pericentrická inverze – zahrnuje centromeru; mění typ chromosomu

• translokace

  • • nereciproká translokace – odtržení části chromatidy a připojení na jinou chromatidu jiného chromosomu

    • reciproká translokace – vymění se části nehomologních chromosomů

    • Robertsonovská translokace – z akrocentrických chromosomů vznikne metacentrický

VIZUALIZACE CHROMOSOMŮ

• • klasické barvení – roztok Giemsa-Romanowski (obr. a)

  • G-pruhování (GTG) – trypsin + Giemsa

    • každý G-pruh (oblasti genů na chromosomu) má své číslo

  • R-pruhování (reverse banding) – acridine-orange (obr. c)

    • reverzní ke G-pruhování

  • C-pruhování (constitutive heterochromatin) – barvení centromer (obr. d)

  • Ag-NOR (nucleolar organizers) – barvení stříbrem – zviditelnění satelitů akrocentrických chromosomů (oblastí, které kódují rRNA)

  • fluorescenční barviva

    • DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) – modrá

    • PI (proprium iodide) – červená

    • chinakrin – zelená – Q-pruhování (obr. b)

    • ethdium bromid

  • TOTO

  • YOYO

FISH (fluorescent in situ hybridization)

• • umožňuje lokalizovat geny nebo jinou specifickou DNA přímo na cytogenetickém preparátu

    • sonda (angl. probe) – značená fluorescenčně – váže se ke komplementárnímu úseku na denaturovaném chromosomu

    • známe sekvenci DNA, jejíž poloha nás zajímá na chromosomu → označíme úsek komplementární ke genu, na kterém je navázána fluorescenčnímolekula (sonda) → denaturace DNA i sondy → renaturace → spojí se vlákno sondy a původní DNA → svítí jen část chromosomu s komplementární sekvencí

  • typy sond:

    • • satelitní – centromerické, telomerické, Y-heterochromatinová

    • lokus-specifické („genové“)

      • malovací – celochromosomové, hybridizující s částmi chromosomů

      • při vizualizaci často kombinace více typů sond (např. lokus-specifická pro lokus SRY na Y chromosomu a centromerická)

    • SKY (spectral karyotyping) – každý chromosom specifický odstín, detekce chromosomových aberací – hlavně translokace)