Chromosomy
jádro lidské buňky průměr asi 5-8 mikrometrů × DNA v jádře dlouhá 2 metry → DNA velmi sbalena – tak, že může interagovat s enzymy + dalšími proteiny nutnými pro transkripci, replikaci a reparaci
chromosom se skládá z 1 dlouhé lineární molekuly DNA, na které jsou navázány proteiny → svinutí do kompaktnější struktury
zdvojený chromosom – má 2 chromatidy (každá chromatida = 1 vlákno DNA)
komplex DNA a proteinů = chromatin (chroma = barva → barvitelný)
proteiny napomáhají sbalení + podílejí se na genové expresi, replikaci a reparaci DNA
u člověka všechny somatické buňky obsahují 2 kopie každého chromosomu 1 páru = homologní chromosomy
× jediný nehomologní pár – pohlavní chromosomy X a Y
STAVBA CHROMOSOMU
chromatida – krátké (p-) raménko a dlouhé (q-) raménko
telomery na koncích (repetitivní sekvence)
centromera (repetitivní sekvence)
+ kinetochory = proteinové struktury; při mitóze se na ně připojují kinetochorová vlákna (~ mikrotubuly); pokud poškozeny či chybí → chromosom se při mitóze ztrácí a vznikají aneuploidní buňky
TYPY CHROMOSOMŮ
autozom
nepohlavní chromosom
u člověka v klasické tělní buňce 22 párů
autozomální dědičnost = dědičnost genů ležících na autozomech
gonozom
pohlavní chromosom
sestava gonozomů se liší dle pohlaví a typu určení pohlaví (člověk – X a Y)
gonozomální dědičnost = dědičnost genů ležících v nehomologní části gonozomů
homologické (homologní) chromosomy
chromosomy 1 páru
mají shodnou velikost, polohu centromery, stejný obsah genů (ne alel!)
stejným způsobem se barví, párují se při meióze – tvoří bivalenty
párování zajišťuje synaptický komplex – proteinová struktura (2 laterální elementy spojeny příčnými vlákny s centrálním elementem; na obvodu spiralizované vlákno obou chromosomů)
na bivalentech dochází k procesu crossing-over, jehož důsledkem je rekombinace částí chromatid; místa překřížení = chiazmata
metacentrický (mediocentrický) chromosom
p- a q-raménko stejně dlouhé, centromera uprostřed chromosomu
může vzniknout při mutaci translokací 2 akrocentrických chromosomů (Robertsonovská translokace)
submetacentrický (submediocentrický) chromosom
krátké (p-) a dlouhé (q-) raménko, centromera není uprostřed chromosomu
akrocentrický chromosom
místo p-raménka satelit (distální segment chromozomu oddělený od vlastního chromozomu úzkou částí nazývanou sekundární konstrikce), centromera téměř na konci chromosomu
telocentrický chromosom
p-raménko chybí, centromera na konci chromosomu
acentrický chromosom
chromosom, který ztratil centromeru
holocentrický chromosomchromosom, u kterého není centromera lokalizována do 1 místa, ale centromerická aktivita je rozptýlena po celém chromosomu = celý chromosom je centromerou
nelze rozlišit raménka
při mitóze se připojuje k vláknům dělicího vřeténka po celé své délce; pokud se rozpadne na více menších částí, každýz fragmentů si zachovává schopnost aktivně se připojit k dělicímu vřeténku
pouze u některých organismů: u rostlin čeledi Juncaceae (sítiny) a Cyperaceae (šáchorovité – ostřice), u živočichů hlísti a pavoukovci
polyténní chromosomchromosom, na kterém došlo k několikanásobné replikaci, ale nedošlo k následnému rozpadu na jednotlivéchromatidy (jednochromatidové chromosomy)
ideální model pro studium strukturních aberací (obrovské, snadno pozorovatelné)
feminizující X* chromosom
chromosom, který podmiňuje vznik samičího pohlaví
XX ♀, X*X ♀, X*Y ♀, XY ♂ – způsobuje převahu samic
samice X*Y mají potomky X*X : X*Y : XY : YY (neživotaschopní) v poměru 1 : 1 : 1 : 1
vyskytuje se u lumíka velkého
stav chromosomů se mění během buněčného cyklu
chromosomy obvykle rozvolněné (dlouhá, tenká, vzájemně propletená vlákna)
× kondenzované jen v malé části buněčného cyklu
vysoce kondenzované chromosomy v dělících se buňkách (při mitóze) = mitotické chromosomy
× rozvolněnější chromosomy = interfázové (interfázní) chromosomy
kondenzovaný stav důležitý při snadném oddělení zduplikovaných chromosomů (asistence mitotického vřeténka)
vysoce kondenzované chromosomy také při meióze
specializované sekvence DNA zajišťují účinnou replikaci chromosomů
chromosomy fungují jako samostatné strukturní jednotky → každý se musí samostatně zreplikovat,…
→ to kontrolují 3 typy specializovaných sekvencí:
replikační počátky
začátek duplikace DNA
většina chromosomů obsahuje více počátků → zrychlení replikace
centromery
zajišťují rozchod replikovaných chromosomů do dceřiných buněk při mitóze – na centromerách proteinové komplexy = kinetochory – ty váží chromosomy na dělící vřeténko a umožňují tak oddělit se od sebe
telomery
na obou koncích chromosomu
obsahují repetitivní sekvence, které umožňují replikaci konců chromosomů – DNA-polymeráza může syntetizovat DNA jen ve směru 5′→3′ → problém při opožďujícím se řetězci – primery nemohou vzniknout na úplném konci chromosomu → při každé replikaci by docházelo ke ztrátám koncových oblastí
enzym telomeráza (reverzní transkriptáza) – přidává mnoho kopií stejné sekvence (má vlastní RNA komplementární k repetitivní sekvenci DNA) → vznikne templát pro dosyntetizování opožďujícího řetězce
telomeráza funguje jen v embryonálním vývoji (pak je její funkce blokována) → po narození a během života již nepracuje → telomery se při každém buněčném dělení zkracují, až dosáhnou určitédélky, kdy se buňka přestává dělit → 1 z příčin stárnutí
u člověka telomery dlouhé na 50-60 dělení (Hayflickův limit: Hayflick L., Moorhead P.S. (1961) The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research, 25:585-621) × pro postavení našeho těla stačí mnohem méně + asi 20 % se využije pro regeneraci
pojistka proti nádorům
pokus: myši odebrány geny pro telomerázu → nestalo se jí nic, pouze měla kratší telomery → až v 7. generaci zkráceny natolik, že byl problém v tkáních, které se rychle obnovují (střevní epitel)
Nobelova cena za objevení telomerázy (2009) – Jack W. Szostak
další funkce telomer: repetice telomerázových sekvencí a přilehlé oblasti vytvoří strukturu, která chrání chromosom před DNA-nukleázami (ty přednostně degradují konce molekul DNA)
CHROMATIN = komplex DNA a proteinů
dle fáze buněčného cyklu se mění jeho stav
v interfázi rozvolněný → umožňuje přístup proteinů potřebných pro expresi genů/replikaci
před vstupem do mitózy další postupné sbalování chromatinu → vzniknou vysoce kondenzované mitotické chromosomy – zde již zreplikovaná DNA + transkripce zastavena
→ kontrola genové exprese
epigenetika
tzv. chromatinová dědičnost → strukturní i chemické modifikace chromatinu (ne změny v sekvenci nukleotidů!) → acetylace, methylace, ubiquitylace, sumoylace, fosforylace
velké změny v epigenetické úpravě chromatinu hlavně v embryonálním vývoji, pubertě a při stárnutí; mladí jedinci zpravidla rezistentní; v průběhu ontogeneze epigenetické změny reverzibilní
např. genomový imprinting (též parentální, gametický)
imprintovaná alela = methylovaná alela (navázání –CH3) = neaktivní alela
→ nemá fenotypový projev → pokud heterozygot a methylovaná alela je dominantní, neprojeví se a fenotyp závisí na recesivní alele (tento heterozygot se pak chová jako recesivní homozygot)
např. alela A pro červenou barvu a alela a pro bílou barvu květů
→ normálně heterozygot Aa červené květy × pokud alela A imprintovaná, heterozygot Aa má bílé květ
záleží, od kterého rodiče imprintovaná alela zděděna
maternální imprinting (od matky), paternální imprinting (od otce)
nukleosom
nukleosomové jádro + sousední spojovací úsek DNA
základní jednotka kondenzace chromatinu
objevení struktury: naštěpení rozvinutého chromatinu specifickou nukleázou → rozštěpila DNA mezi jednotlivými nukleosomy (ne úplně na jednotlivé nukleotidy)
jádro nukleosomu: komplex 8 histonů = histonový oktamer
histony H2A, H2B, H3, H4 (každý po 2 molekulách)
+ dvouřetězcová DNA o délce 146 nukleotidových párů
DNA obtočena kolem oktameru 1,45x – tak se zkrátí až na 1/3 své původní délky
histony = malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých AK (lysin, arginin) → pevné navázání histonů na záporně nabité fosfátové skupiny DNA (bez ohledu na sekvenci)
v buňce kolem 60 mil. molekul od každého typu! – evolučně nejvíce konzervované proteiny u eukaryot → nezbytné při formování chromatinu
N-konce cílem posttranslačních modifikací (trčí ven z nukleosomů) → acetylace, methylace, ubiquitylace, sumoylace, fosforylace → modifikace vedou ke změnám vazby histonů na DNA –rozvolňují/kompaktují strukturu
nukleosomy od sebe vzdálené asi 200 nukleotidových párů (146 omotáno kolem jádra nukleosomu, zbytek asi 50 spojuje sousední jádra)
nukleosomy nebrzdí RNA-polymerázu při transkripci, nejsou překážkou ani při replikaci – dochází jen k reorganizaci nukleosomových proteinů
STRUKTURA CHROMOSOMU (spiralizace)
několik úrovní:
„korálková“ forma chromatinu (10 nm) – jen velmi zřídka
30nmetrové vlákno (30 nm)
nukleosomy těsně přiloženy k sobě → kompaktnější struktura
histon H1 – drží sousední nukleosomy u sebe v pravidelně se opakujícím uspořádání
rozvolněný chromosom nejčastěji v tomto stavu
smyčky připojené k centrální ose – odstupují směrem ven (= průměr chromosomu 700 nm)
celkový chromosom (1400 nm)
vysoká kondenzace → zablokování transkripce (RNA-polymeráza a ostatní proteiny se nemohou vázat na DNA)
stupeň spiralizace jednotlivých oblastí DNA závisí také na její aktuální aktivitě
INTERFÁZOVÉ CHROMOSOMY
po mitóze se chromosomy rozvolňují (dekondenzují)
× ne ve všech oblastech chromosomu stejně – v rámci 1 chromosomu se mohou vyskytovat všechny stupně kondenzace (transkribované oblasti rozvolněnější, nepřepisované kondenzovanější)
jednotlivé chromosomy se liší v různých buněčných typech (v závislosti na tom, které geny jsou přepisovány)
heterochromatin
nejvíce kondenzovaná forma chromatinu (heteros = odlišný)
silně se barvící oblasti chromatinu
> 10 % interfázových chromosomů, hl. v okolí centromer a telomer
transkripčně inaktivní
konstitutivní (nikdy se nepřepisuje) a fakultativní (přepisuje se jen za určitých podmínek)
pokud se normální geny dostanou do heterochromatinové oblasti, inaktivují se
polohový efekt – např. gen white (Drosophila), gen ADE2 (kvasinka)
typický příklad: inaktivace 1 z chromosomů X u samic savců
dvojnásobné množství produktů X chromosomu by bylo letální → 1 chromosom X (od otce nebo od matky) trvale inaktivován – na začátku embryonálního vývoje, kondenzace náhodná (v dalších buněčných generacích pak kondenzován vždy stejný X chromosom)
poměr inaktivovaných a aktivovaných X chromosomů od otce a od matky je zhruba 1 : 1 (důkaz náhodnosti procesu) – výjimka jen vačnatci, tam vždy inaktivován X od otce
euchromatin
zbytek v různém stupni kondenzace (eu = pravý, normální)
v typické diferencované eukaryotní buňce asi 10 % chromatinu aktivně přepisováno nebo ve stavu snadno přístupném transkripci
aktivní chromatin
špatně barvitelný
interfázové chromosomy jsou v jádře organizovány
každý chromosom má své místo = teritorium – podílí se i vazba určitých částí chromosomu na membránu jádra, laminu
poloha chromosomu závisí na:
velikosti chromosomu – malé chromosomy jsou spíše ve středu, velké častěji v okrajových částech
na genové denzitě – genově chudé oblasti blíže k jadernému obalu
době replikace – oblasti, které replikovány později, jsou v periferních oblastech a kolem jadérka
poloha by se neměla měnit – důležité v expresi → při nádorech dochází ke změně uspořádání
nukleolus (jadérko) = spojení určitých částí různých chromosomů, kde jsou geny pro syntézu rRNA a ribozomálních proteinů (satelity akrocentrických chromosomů) + zde sestavovány ribozomální podjednotky (proteiny transportovány z cytoplazmy)
není ohraničeno žádnou membránou
NOR (nucleolus organizer region) = oblast formování jadérka, u člověka jsou to krátká raménka chromozomů 13, 14, 15, 21 a 22, která obsahují geny pro 5,8S, 18S, a 28S rRNA
mezi teritorii volné prostory – v nich enzymy pro transkripci, replikaci, splicing,…
KARYOTYP
druhově charakteristický soubor chromosomů v buňce (počet, struktura, eventuálně pruhovací pattern)
lidské chromosomy – skupiny (dělí se podle jejich makrostavby):
A – chromosomy 1, 2, 3 – velké metacentrické
B – chromosomy 4, 5 – velké submetacentrické
C – chromosomy 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X – střední submetacentrické
D – chromosomy 13, 14, 15 – střední akrocentrické
E – chromosomy 16, 17, 18 – malé submetacentrické
F – chromosomy 19, 20 – malé metacentrické
G – chromosomy 21, 22, Y – malé akrocentrické
člověk nemá telocentrické chromosomy
POHLAVNÍ CHROMOSOMY (GONOZOMY)
chromosomy X a Y (XX ♀, XY ♂) – savci (člověk!) a některé ryby, obojživelníci, plazi, korýši, hmyz (např. Drosophila) a některé rostliny
chromosomy Z a W (ZZ ♂, ZW ♀) – ptáci, motýli a některé ryby, obojživelníci, plazi, korýši a některé rostliny
pohlaví homogametické: XX, ZZ × heterogametické: XY, ZW
nepárový chromosom = Y, W
vznik a diferenciace gonozomů
vznik (mutací) genu určujícího pohlaví na autozomálním páru
nahromadění sexuálně antagonistických genů (výhodných pro 1 pohlaví, pro druhé nevýhodných) kolem genu určujícího pohlaví → větší šance dostat se znovu do stejného pohlaví
potlačení rekombinace v okolí genu určujícího pohlaví (např. prostřednictvím inverze – u vzniku lidských gonozomů došlo postupně k 4 inverzím) → aby se nikdy nedostal do špatného pohlaví
postupná divergence a degenerace nerekombinující části nepárového gonozomu
gonozomy XY i ZW vznikly v evoluci mnohokrát – ale mají spoustu společných znaků
Y, W menší nebo chybí
Y, W obsahují jen málo funkčních genů
Y, W nesou hodně nefunkčních pseudogenů (úsek DNA, který má vysokou homologii s funkčním genem, ale sám není transkribován – předpokládá se, že pseudogeny vznikly z funkčních genů během evoluce), transpozonů (pohyblivé, „skákající“ sekvence DNA), repetitivních sekvencí; z velké části tvořeny heterochromatinem
Y, W obsahují velké množství palindromů (sekvencí, které se čtou stejně zepředu i zezadu) – mezi homologními sekvencemi dochází často ke genové konverzi (= přepisu 1 sekvence podle druhé) – může si vybrat, jestli bude párovat se sekvencí na stejném nebo druhém vlákně → může způsobit zpomalení hromadění škodlivých mutací
nenáhodný genový obsah
XY a ZW prodělávají podobné epigenetické změny během gametogeneze u heterogametického pohlaví
chromosomy X a Y (resp. Z a W) mají část homologní (= pseudoautosomová – geny jsou v této části v obou kopiích, dědičnost se může jevit jako autozomální) a heterologní (větší část, geny obsaženy jen v 1 kopii)
důsledky evoluce gonozomů
kompenzace dávky genů na chromosomu X (transkripční up-regulace)
vzniká nerovnováha v dávce genů mezi pohlavími (♀ nesou 2 kopie X-vázaných genů × ♂ nesou jen 1 kopii) → kdyby nebyla vyrovnána, ♀ XX by vykazovaly dvojnásobnou expresi X-vázaných genůnež ♂
savci: u ♀ inaktivace 1 chromosomu X (= lyonizace, viz níže)
Drosophila: u ♂ zvýšená transkripce chromosomu X
Caenorhabditis elegans: u ♀ snížená transkripce obou chromosomů X
u ZW organismů není kompenzace dávky genů (jen lokálně u některých genů) – důvody nejasné
meiotická inaktivace gonozomů
transkripční inaktivace gonozomů během meiózy
jen u heterogametického pohlaví
XY inaktivace během spermatogeneze, ZW inaktivace během oogeneze
u většiny organismů – inaktivované gonozomy = heterochromatinové tělísko (sex body)
význam: speciální forma běžné inaktivace jakékoli nespárované DNA, ochrana před sobeckými geny na gonozomech
problémy:
Turnerův syndrom (45, X) – monosomie – chybí 1 gonozom
Klineferterův syndrom (47, XXY) – trisomie – navíc 1 chromosom X
superfemale (47, XXX) – více X chromosomů
supermale (47, XYY) – navíc 1 Y chromosom
LYONIZACE
inaktivace chromosomu X u savců
způsob kompenzace dávky u homogametického pohlaví
pokud v buňce více než 2 chromosomy X (např. Klineferterův syndrom), inaktivace všech kromě jednoho (buňka má schopnost počítat si X chromosomy)
1961 objev inaktivace – Mary Lyon (odtud lyonizace)
oba X chromosomy aktivní jen v časném embryonálním vývoji → inaktivace po vzniku blastuly (při diferenciaci buněk) × během oogeneze opět X-reaktivace
inaktivace u většiny placentálních savců náhodná (nezáleží, jestli X chromosom pochází od matky nebo od otce) × u vačnatců vždy inaktivován X chromosom od otce
inaktivovaný X chromosom = Barrovo tělísko
heterochromatin, kondenzovaný během interfáze (= sex chromatin; je barvitelný)
téměř netranskribován (výjimkou jsou např. geny nacházející se v části homologní s chromosomem Y)
replikace v pozdní S-fázi buněčného cyklu
regulace inaktivace
XIC (X chromosome inactivation center, sekvence asi 106 nukleotidových párů) – zde inaktivace začíná a pokračuje podél chromosomu
pokud delece → chromosom nemůže být inaktivován
translokace na autozom → inaktivuje se autozom
součástí XIC je XCE – regulační element → rozhoduje o tom, zda X chromosom bude inaktivován
součástí XIC je lokus XIST (X-inactive specific transcript) – transkribován jen z neaktivního X chromosomu
produktem je nekódující RNA → obaluje chromosom – po sestřihu zůstává v jádře, je součástí Xist body
× gen TSIX (antisence XIST) – udržuje v aktivním stavu druhý X chromosom
CHROMOSOMOVÉ ABERACE (MUTACE)
A) Změna počtu:
aneuploidie – týká se 1 chromosomu
monozomie (např. Turnerův syndrom – 45, X0), trisomie (např. Downův syndrom – 47, XX, +21, Klineferterův syndrom – 47, XXY)
příčina: nondisjunkce (nerozpojení) homologických chromosomů při meióze – oba chromosomy přejdou do 1 buňky → v jedné buňce je chromosom navíc (trisomie), ve druhé buňce chybí (monosomie)
trisomie se objevuje častěji (jedinci přežijí spíše s chromosomem navíc, než kdyby chyběl)
trisomie tolerovány spíše u malých chromosomů a gonozomů
míra postižení závisí na velikosti chromosomu a jeho genovém obsahu
lépe snášejí rostliny – např. aneuploidie u durmanu ovlivňuje tvar plodu
polyploidie, euploidie – týká se celé sady chromosomů = genomová mutace (lépe tolerován sudý počet násobků)
polyploidie u rostlin – využití v zemědělství → větší výnos
tetraploidi: kukuřice, bavlna, brambor, zelí
hexaploidi: pšenice, chysantéma
oktaploid: jahodník
polyploidie u živočichů – tolerována u Drosophily, měkkýšů, ještěrek, obojživelníků, ryb (hojná, např. kapr, pstruh,…)
vyskytuje se i u člověka a je normální – hepatocyty (buňky jater)
B) Změna struktury:
při reparaci chromosomových zlomů (interchromosomové přestavby většího rozsahu), následkem nerovnoměrného crossing-overu (intrachromosomové přestavby malého rozsahu)
mutagen schopný vyvolat zlom = klastogen – např. UV-záření, různé chemické mutageny
delece – vypadnutí jednoho nebo více nukleotidů
např. Cry du chat syndrom (delece v 5p) – pláč novorozenců připomíná mňoukání, nízká porodní váha, nízký svalový tonus, IQ asi 20
duplikace – znásobení nukleotidů
inverze – převrácení několika nukleotidů; nemusí vadit, pokud na 1 rameně × problém při gametogenezi
pericentrická inverze – zahrnuje centromeru; mění typ chromosomu
translokace
nereciproká translokace – odtržení části chromatidy a připojení na jinou chromatidu jiného chromosomu
reciproká translokace – vymění se části nehomologních chromosomů
Robertsonovská translokace – z akrocentrických chromosomů vznikne metacentrický
VIZUALIZACE CHROMOSOMŮ
klasické barvení – roztok Giemsa-Romanowski (obr. a)
G-pruhování (GTG) – trypsin + Giemsa
každý G-pruh (oblasti genů na chromosomu) má své číslo
R-pruhování (reverse banding) – acridine-orange (obr. c)
reverzní ke G-pruhování
C-pruhování (constitutive heterochromatin) – barvení centromer (obr. d)
Ag-NOR (nucleolar organizers) – barvení stříbrem – zviditelnění satelitů akrocentrických chromosomů (oblastí, které kódují rRNA)
fluorescenční barviva
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) – modrá
PI (proprium iodide) – červená
chinakrin – zelená – Q-pruhování (obr. b)
TOTO
FISH (fluorescent in situ hybridization)
umožňuje lokalizovat geny nebo jinou specifickou DNA přímo na cytogenetickém preparátu
sonda (angl. probe) – značená fluorescenčně – váže se ke komplementárnímu úseku na denaturovaném chromosomu
známe sekvenci DNA, jejíž poloha nás zajímá na chromosomu → označíme úsek komplementární ke genu, na kterém je navázána fluorescenčnímolekula (sonda) → denaturace DNA i sondy → renaturace → spojí se vlákno sondy a původní DNA → svítí jen část chromosomu s komplementární sekvencí
typy sond:
satelitní – centromerické, telomerické, Y-heterochromatinová
lokus-specifické („genové“)
malovací – celochromosomové, hybridizující s částmi chromosomů
při vizualizaci často kombinace více typů sond (např. lokus-specifická pro lokus SRY na Y chromosomu a centromerická)
SKY (spectral karyotyping) – každý chromosom specifický odstín, detekce chromosomových aberací – hlavně translokace)
METODA BUNĚČNÉ HYBRIDIZACE
používá se pro přiřazení lidských genů k chromosomům
využití mezidruhové hybridizace mezi myšími a lidskými buňkami
fúze myší a lidské buňky vhodných genotypů → vzniká hybridní buňka obsahující myší i lidské chromosomy
selekce produktů fúze na vhodném médiu (HAT médium – živiny + hypoxantin + aminopterin + thymidin) – přežijí jen hybridi
cytogenetická a biochemická, popř. imunologická, analýza hybridních klonů
charakteristickým rysem je nestabilita a postupné (náhodné) vytrácení lidských chromosomů → dospěje se ke stabilní linii jen s několika lidskými chromosomy
zjišťuje se, který gen mají linie společný a také které chromosomy → podle toho se určí, na kterém chromosomu gen leží